IgG lieferte keine Signale, puma basket platform patent die auf eine Immunpräzipitationsspezifität hinweisen. Die EGFR-PUMA-Wechselwirkung wurde über Reverse IP unter Verwendung eines PUMA-Antikörpers bestätigt (Fig. S2 in Supplemental Data). Ein früherer Bericht [36] zeigte, dass EGFR im Zytoplasma in freier, nicht membrangebundener Form vorliegen kann. In diesem Zusammenhang wird aktiviertes EGFR auf der Zelloberfläche endozytiert und zum ER transportiert, wo es mit Sec61beta, einer Komponente des Sec61-Translokons, assoziiert und dann als nicht membrangebundener Rezeptor vom ER zum Zytoplasma retrotransloziert wird. [37] . Unsere Ergebnisse in Abb. S2 in Supplemental Data zeigen, dass PUMA hauptsächlich mit dem EGFR-Protein interagiert, das nicht mit Plasmamembranen assoziiert ist.

Die Regressionsanalyse zeigt ferner, dass die Koexpression von EGFR allein, PUMA allein und EGFR / PUMA signifikant mit dem Gliomgrad korreliert (2a). Zwei repräsentative immungefärbte Gliome sind in 2b gezeigt, in denen ein GBM (oberes Feld) sowohl für EGFR / EGFRvIII als puma basket platform white auch für PUMA eine positive Färbung zeigt und im Gegensatz dazu ein Grad II-Gliom (unteres Feld) für beide Proteine   negativ färbt. Der im EGFR / EGFRvIII-IHC verwendete Antikörper erkennt ein C-terminales Epitop, das sowohl im EGFR- als auch im EGFRvIII-Rezeptor vorhanden ist, und aufeinanderfolgende Tumorschnitte puma basket rosa wurden in diesen Studien verwendet. Der hohe Grad der EGFR / EGFRvIII-PUMA-Co-Expression in primären GBM-Proben stimmt mit den Beobachtungen in 1 mit den GBM-Zelllinien überein.

In Übereinstimmung mit den Ergebnissen in Fig. S1 wurde festgestellt, dass eine Teilpopulation von GBM PUMA exprimierte, jedoch keine wesentlichen Mengen von EGFR / EGFRvIII.EGFR / EGFRvIII und PUMA in GBM-Primärproben coexprimierten und das Ausmaß der Coexpression signifikant beeinflusste korreliert mit dem Gliomgrad. (A) EGFR / EGFRvIII koexprimiert signifikant mit PUMA in primären GBMs. Eine Kohorte von 101 Gliomen und 12 normalen Hirngeweben wurde einer IHC-Färbung auf EGFR / EGFRvIII puma basket sale und PUMA unterzogen, wobei 55 Gliome und 5 normale Hirngewebe zuvor auf EGFR / EGFRvIII gefärbt worden waren [9]. Der in diesen Studien verwendete EGFR-Antikörper erkannte sowohl EGFR als auch EGFRvIII.

Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar von U87MG-EGFRvIII- und U87MG-Vektorzellen. Die Mitochondrienfraktionierung / Western-Blotting (5a) zeigte, dass PUMA in erster Linie in den nicht mitochondrialen Fraktionen von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter nicht belasteten Bedingungen lokalisiert war und sich nach Exposition gegenüber den apoptotischen Induktoren Staurosporin (ST) und einer moderaten mitochondrialen Translokalisierung unterzog Anisomycin (AN). Wie durch den niedrigen mtPUMA-Index (0-0,02) angezeigt, ist der Großteil von PUMA in den nicht mitochondrialen Fraktionen der EGFRvIII-exprimierenden U87MGEGFRvIII-Zellen sequestriert (5a).

PUMA ist im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen unabhängig von apoptotischem Stress sequestriert. Das Ausmaß der mitochondrialen PUMA-Translokalisierung, mtPUMA-Index, wird wie unter Materialien und Methoden beschrieben berechnet. (A) PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen lokalisiert. Mit Vehikelkontrolle, Staurosporin (ST, 1 uM) oder Anisomycin (AN, 100 ng / ml) behandelte U87MG-EGFRvIII-Zellen wurden geerntet und in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert. Proteinextrakte aus beiden Fraktionen wurden einem Western Blot puma basket satin unterzogen, um PUMA, ±-Tubulin (cytoplasmatischer Marker) und Cox IV (mitochondriales Protein) nachzuweisen.

In Kontroll-siRNA-behandelten natürlichen T98G-GBM-Zellen ist PUMA hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. In EGFR-spezifischen siRNA-behandelten Zellen beobachteten wir einen deutlichen Anstieg des mitochondrialen PUMA (linkes Feld). EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (rechtes Feld). Lamin B: Kernprotein. ME: mitochondriale Extrakte. NME: nicht mitochondriale Extrakte. (D) PUMA wird im Zytoplasma EGFR-exprimierender menschlicher Brustkrebszellen sequestriert. MDA-MB-468-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie hohe Mengen an endogenem EGFR exprimieren [34], wurden mit und ohne Staurosporin behandelt, in mitochondriale und [url=awakesummerbreak.de/puma-basket-satin-p-197.html][img]http://www.awakesummerbreak.de/images/shoes/puma-nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert und Proteinextrakte wie zuvor beschrieben analysiert.